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IHC培训第1周:入门

去年9月份的时候,小编推荐了Abcam的WB新手入门课程(每周一节,共分4节),不知道小伙伴们有没有get到WB的全套技能呢?现在,Abcam推出了实验必备的升级技能---IHC,同样是以每周一次课程的形式。跟着小编学起来吧!

在第 1周的 IHC 培训中,我们将展示如何开启一个良好的开端。如何制备样本将会成为决定最终数据质量的重要影响因素。本次培训中,我们将指导您完成 IHC 最佳样本处理的主要步骤。

1、什么是免疫组化?

免疫组化(immunohistochemistry,IHC)是利用抗原-抗体相互作用显示组织切片中抗原分布和定位的一种方法。

IHC 常用于诊断癌症等疾病中的异常细胞和组织。总体而言,IHC 提供了有价值的观点和支持,使其他方法获得的数据更加有据可依。

IHC 染色依赖于识别靶蛋白的抗体,可以通过两种检测方法对抗原-抗体的相互作用进行可视化,一种是显色方法(酶偶联抗体催化底物显色,产生有色沉淀);另一种是荧光检测法(荧光基团偶联抗体产生荧光)。

2、标本形式

IHC组织保存的两种主要方法是石蜡包埋和组织冰冻(总结如下):

  IHC-石蜡包埋 IHC-组织冰冻
  切片厚度     4-5 µm 4-10 µm
固定

最常用10%中性福尔马林缓冲液 (neutral-buffered formalin, NBF) 预包埋

切片前或切片后,多聚甲醛、丙酮或丙酮: 乙醇 1:1 溶液
切片 切片机 冰冻机
储存 室温下储存数年(抗原可能随时间变化) -80℃ 下储存 1 年(-190℃ 下保存时间更长)
优点

- 形态结构保存与抗原性的最佳平衡;

- 非常稳定且易于使用;

- 抗原处于更“天然”的状态;

- 适用于不耐受标准醛固定和石蜡处理的抗原;

- 适用于磷酸化抗原表位;

缺点

- 过度固定(超过 24 小时)可掩盖抗原表位;

- 免疫染色前需要脱蜡;

- 使用交联 [醛] 试剂固定需要进行抗原修复;

- 如果形成冰晶,形态保存可能比石蜡切片差;

- 切片过厚会导致图像分辨率较低,图片拍摄效果较差;

- 样本易碎;

3、固定

固定可防止离体组织自溶和坏死,保留抗原特性,提高组织成分的折射率,同时有助于保护样本处理过程中的细胞成分。靶抗原和所需的检测技术都会影响固定剂的选择,如下图所示。

图 1:固定剂对免疫染色效果的影响。和甲醛固定(左)相比,用甲醇固定的 HeLa 细胞(右)中更易检出组蛋白 H2B K5 巴豆酰化免疫组化结果。一抗:ab177139,组蛋白 H2B(K5巴豆酰化)的兔多克隆抗体,1 μg/mL。二抗:ab150081,山羊抗兔 IgG H&L (Alexa Fluor® 488),0.5 μg/mL。DAPI 染核, ab7291 搭配ab150120 染微管蛋白(红色)。

 

以下是我们关于固定剂选择的建议:

· 大多数低分子量的蛋白质、多肽和酶对于细胞/细胞学样本制备,使用 4% 甲醛;对于组织切片,使用 10% 中性福尔马林缓冲(NBF)液;

·  柔软精细组织:Bouin 固定液;

·  氨基酸等小分子:4% 甲醛;

·  造血器官(如肝、脾、骨髓):Zenker 固定液;

·  结缔组织:Helly 固定液;

·  核酸:Carnoy 固定液;

·  大分子蛋白抗原(如免疫球蛋白):冰浴丙酮或甲醇(100%);

·  细胞核形态:福尔马林-硫酸锌溶液;

·  电镜成像:4% 甲醛,1% 戊二醛溶液。

4、包埋和切片

固定组织后需立即处理,以充分保证组织被切成厚度为 4-5 μm 。组织经脱水、透明化,然后浸蜡,以进行切片。本方案包括

·   石蜡组织处理

·   冰冻组织包埋

·   乙二醇甲基丙烯酸酯 (Glycol methacrylate, GMA) 包埋

小结

希望您现在已经具备良好的前期基础,可以开始计划您的 IHC 实验。您应该对样本制备有更多了解,尤其是:IHC 样本保存的两种主要方法,以及组织固定和包埋方法。

下周我们将介绍免疫组化染色原理以及抗原修复、通透化和封闭。

 

本文内容来源于abcam官网。

 

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